Transgene Tiere für das Verständnis physiologischer Prozesse und pathologischer Veränderungen

Von der Grundlagenforschung mit gentechnisch veränderten Mäusen zu neuen Therapieformen in der Medizin

Gentechnisch veränderte Mäuse werden auf allen Gebieten der Grundlagenforschung eingesetzt, wie beispielsweise zur Analyse stoffwechselphysiologischer Prozesse bei der Entwicklung des Organismus oder auch zum Verständnis induzierter Reaktionen bei der Immunabwehr gegen pathogene Mikroorganismen. Darüber hinaus dienen sie als Modell zur Untersuchung genetisch bedingter humaner Erkrankungen wie Krebs, Morbus Alzheimer, Parkinson und Autoimmunerkrankungen wie juveniler Diabetes oder Multiple Sklerose. Auch bei der Entwicklung neuer Therapien spielen sie eine wichtige Rolle. Mäuse weisen die Vorteile einer relativ kurzen Generationszeit und eines bereits gründlich charakterisierten Erbgutes auf, ausserdem sind bei ihnen die Methoden zur gezielten Mutagenese etabliert. Auch wenn sie manche menschlichen Krankheiten nur teilweise widerspiegeln, so stellen sie doch die beste Alternative zum Versuch am Menschen dar. Bei Roche kommen sie vorrangig bei der Suche nach Arzneimitteln gegen die Alzheimer Krankheit zum Einsatz. In Zusammenarbeit mit der Uni Zürich wird mit gentechnisch veränderten Mäusen nach spezifischer wirkenden Beruhigungsmitteln ohne unerwünschte Nebeneffekte geforscht.

1. Zwei Möglichkeiten zur Veränderung des Erbgutes

Unter der Bezeichnung „transgene“ Tiere werden im allgemeinen alle gentechnisch veränderten Tiere verstanden. Es existieren zwei grundsätzlich verschiedene Methoden, das Erbgut von Tieren gezielt zu verändern: Durch das Einfügen eines zusätzlichen Gens in den Zellkern einer befruchteten Eizelle entstehen transgene Tiere mit neuen Eigenschaften. Wird dagegen gezielt ein vorhandenes Gen ausgeschaltet, kommen sogenannte „knock out“-Tiere zustande, denen jeweils die durch dieses Gen hervorgerufene Eigenschaft fehlt. Diese Methode lässt sich auch so abwandeln, dass das betreffende Gen nur geringfügig verändert, aber nicht ausgeschaltet wird („knock in“-Tiere).

Es können auf diese Weise gezielt genetische Veränderungen (Mutationen) in das Erbgut der Maus eingeführt werden, die beim Menschen als krankheitsverursachend erkannt wurden. Entwickelt daraufhin die transgene Maus eine Krankheit, die jener beim Menschen gleicht, können an ihnen Ursachen, Entstehung und Bekämpfungsmechanismen sowie die Wirksamkeit von neuen Arzneimitteln erforscht werden. Da aber für die meisten humanen Krankheiten kein Tiermodell existiert, werden die der menschlichen Erkrankung entsprechenden molekularen Veränderungen gentechnisch in Mäusen hervorgerufen.

Beispielsweise ist es möglich, die Alzheimersche Krankheit, Multiple Sklerose, Diabetes oder Chorea Huntington (Veitstanz) bei der Maus nachzubilden. Sowohl die Züchtung als auch die Verwendung transgener Tiere in der medizinischen Forschung sind in der Schweiz bewilligungspflichtig, es gelten die Bestimmungen des schweizerischen Tierschutzgesetzes. Registrierung und Bewilligung erfolgen durch die kantonalen Tierschutzkommissionen, zu denen auch Vertreter des Tierschutzes gehören.

2. Weniger Tierversuche mit gezielt erzeugten Mutanten

Die Vielfalt der Lebewesen geht im wesentlichen auf spontan entstehende Individuen mit verbesserten Eigenschaften zurück, welche die weniger gut angepassten Lebewesen allmählich verdrängen. Eine Selektion von Nachkommen mit spontanen Mutationen hat nicht nur Züchter, sondern auch Wissenschaftler beschäftigt, die sich Rückschlüsse von den veränderten Eigenschaften auf die Funktion der Gene erhofften. Wegen der Zufälligkeit spontaner Mutationen, die ungezielt eines oder wenige von vielen Genen betrafen, stand jedoch zunächst die Beobachtung einer grossen Zahl von Lebewesen im Vordergrund, aus denen dann diejenigen mit neuen Eigenschaften herausgesucht wurden.

Aus diesem Grund wurden für genetische Tests vorrangig sich schnell vermehrende Lebewesen wie Bakterien und Taufliegen verwendet und dabei die Mutationsrate der Gene durch Bestrahlung oder Chemikalien künstlich erhöht. Inzwischen ist es aber möglich, mit Hilfe der Gentechnik Mutationen gezielt an ausgewählten Genen in einem spezifischen Organ zu einem bestimmten Zeitpunkt vorzunehmen.

Der vermehrte Einsatz geeigneter transgener Tiere als auswertbare Krankheitsmodelle im Vergleich zu herkömmlichen Mäusen oder solchen mit spontanen Mutationen leistet einen Beitrag zur Reduktion der Anzahl benötigter Versuchstiere. Ausserdem können gentechnisch veränderte Mäuse bei Impfstofftests gegebenenfalls andere Versuchstiere wie beispielsweise Affen ersetzen.

3. Noch immer bestehen Rätsel um die Alzheimer Krankheit

Die seit etwa hundert Jahren bekannte Alzheimersche Erkrankung verursacht bei den betroffenen Patienten innerhalb weniger Jahre einen fortschreitenden geistigen Verfall, der meist zum vollständigen Verlust eines selbständigen Lebens führt. Durchschnittlich betrifft dies etwa 15 Prozent aller über 65-jährigen Personen, in der Schweiz erkranken jährlich etwa 5000 Menschen neu.

Der bei dieser Krankheit auftretende zunehmende Ausfall von Nervenzellen in der Hirnrinde und anderen Teilen des Grosshirns kann bis heute nicht ausreichend erklärt werden. Unterdessen ist jedoch bekannt, dass zwei Prozesse bei der Entstehung eine wichtige Rolle spielen: Bei dem einen handelt es sich um die übermässige Ansammlung eines bestimmten Eiweissfragments (beta-Amyloid), welches sich ausserhalb der Nervenzellen zu Klumpen zusammenlagert. Bei dem anderen steht ein verändertes tau-Protein im Mittelpunkt, welches innerhalb der Zellen zu Faserbündeln verklebt. Die entstehenden Strukturen beeinträchtigen die Leistungsfähigkeit der Nervenzellen und führen zu deren Absterben.

Bis vor kurzem wurde die Krankheit hauptsächlich an Hirngewebsmaterial Verstorbener studiert. Inzwischen stehen der Wissenschaft verschiedene transgene Mausmodelle zur Verfügung, die die für Alzheimer-Patienten typischen krankhaften Veränderungen im Gehirn aufweisen. Ein Mausmodell enthält als Transgen die menschliche Erbinformation für ein krankhaft verändertes Amyloid-Vorläufer-Protein. Im Gehirn dieser Mäuse entwickeln sich wie bei den Patienten beta-Amyloidaggregate (Plaques) aus Bruchstücken dieses Vorläuferproteins.

Andere Alzheimer-Mäuse enthalten krankhaft veränderte humane Presenilin-Gene, die den Abbau des Amyloid-Vorläufer-Proteins beeinflussen. Werden beide krankheitsauslösenden Gene zusammen in die Maus gebracht, beschleunigt sich die Ablagerung von beta-Amyloid im Gehirn noch. Das Ziel der Forschung bei Roche ist es nun, beispielsweise mit Hilfe solcher Tiermodelle Arzneimittel zu entwickeln, die diese übermässige Bildung und Ablagerung von beta-Amyloid unterdrücken und die damit einhergehende Pathologie verhindern.

4. Spezifischere beruhigende und angstlösende Arzneimittel

Im Rahmen eines anderen, zusammen mit Pharmakologen der Universität Zürich bearbeiteten Projekts wird nach spezifischer wirkenden, beruhigenden (sedativen) beziehungsweise angstlösenden (anxiolytischen) Arzneimitteln gesucht, die nicht wie die meisten der auf dem Markt befindlichen Medikamente zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Ausgangsstoff für die Untersuchungen war das sedativ wirkende und zu den Benzodiazepinen zählende Diazepam (Valium®). Dieses Arzneimittel von Roche dient zur Behandlung akuter und chronischer Spannungs-, Erregungs- und Angstzustände. Bei regelmässiger Anwendung besteht jedoch die Gefahr einer Abhängigkeitsentwicklung mit Zuständen von Schläfrigkeit, Verwirrtheit und Gedächtnisschwäche.

Benzodiazepine reagieren in unterschiedlicher Stärke mit den Rezeptoren für den Neurotransmitter GABA (Gamma-Aminobuttersäure) auf der Oberfläche von Gehirnzellen. Von diesen Rezeptoren sind bisher mindestens 18 Subtypen beschrieben worden. Es ist gezeigt worden, dass die GABAA-Rezeptoren aus fünf Untereinheiten bestehen, die einen ringförmigen Komplex mit einem Chloridionenkanal im Innern bilden. Sobald der Botenstoff GABA andockt, öffnet sich dieser Kanal in der Membran und lässt Chloridionen ins Innere der Nervenzelle einströmen. Benzodiazepine verstärken diesen Effekt. Da sie dabei aber nicht zwischen den verschiedenen Subtypen des GABAA-Rezeptors unterscheiden, entfalten sie zwar den gewünschten therapeutischen Effekt, verursachen aber auch unerwünschte Nebenwirkungen. Enthält die alpha1-Untereinheit des GABAA-Rezeptors infolge einer Punktmutation im Gen anstelle der Aminosäure Histidin ein Arginin, wird die Benzodiazepin-Bindungsstelle auf allen GABAA-Rezeptoren inaktiviert, die eine solche alpha1-Untereinheit aufweisen. Die Wirkung des körpereigenen Neurotransmitters GABA bleibt von dieser Mutation dagegen unbeeinflusst.

GABAA-Rezeptoren mit verschiedenen alpha-Untereinheiten sind in den verschiedenen Bereichen des Gehirns nicht gleichmässig verteilt. Der die sedative Wirkung von Diazepam (Valium®) vermittelnde Subtyp alpha1 kommt vor allem in der Rinde des Gross- und Kleinhirns sowie im Thalamus und Pallidum vor, während alpha2 sich vorrangig im Striatum, Hippocampus, Amygdala und Hypothalamus findet. Der alpha3-Subtyp ist typisch für die monoaminergen und serotonergen Neuronen des Hirnstamms und die cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns. Der alpha5-Subtyp lässt sich hauptsächlich im Hippocampus nachweisen.

Die Wissenschaftler haben nun die Wirkung von Diazepam auf Wildtypmäuse mit der auf transgene (knock in-) Tiere verglichen, bei denen eine Punktmutation alle alpha1-GABAA-Rezeptoren für Benzodiazepine unempfindlich gemacht hatte, nicht aber die anderen Subtypen. Während Wildtypmäuse die üblichen Reaktionen auf Diazepam zeigten, fehlte bei den mutierten Tieren der sedative Effekt sowie die Erinnerungslücken hervorrufende Nebenwirkung (Amnesie). Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass die spezifischen pharmakologischen Wirkungen der Benzodiazepine über die unterschiedlichen Subtypen des GABAA-Rezeptors ausgelöst werden. Somit können Subtyp-spezifische Arzneimittel gefunden werden, die zum Beispiel anxiolytisch wirken, ohne Sedation oder Amnesie hervorzurufen.

5. Die Verfahren der Zellkern- und Blastozysten-Injektion

Zur Herstellung gentechnisch veränderter Mäuse kommen üblicherweise zwei Verfahren zur Anwendung: die Mikroinjektion von Genen in die befruchtete Eizelle und die Mikroinjektion genetisch veränderter embryonaler Stammzellen in die Blastozyste. Als Blastozystenstadium wird beim Säugetier der Abschnitt der Embryonalentwicklung bezeichnet, der nach Abschluss der ersten Zellteilungen erreicht ist, bevor sich der Embryo in die Gebärmutterschleimhaut einnistet.

Die Mikroinjektion in den Vorkern befruchteter Eizellen wurde zu Beginn der achtziger Jahre eingeführt. Wenige Stunden nach der Befruchtung der Eizelle wird eine Lösung, die zahlreiche Kopien des gewünschten Gens enthält, in den mütterlichen oder väterlichen Vorkern injiziert. Daraufhin wird dieses Gen nach dem Zufallsprinzip in das Erbgut der Eizelle eingebaut und bei den folgenden Zellteilungen an die Tochterzellen weitervererbt. Damit sich der entstehende Embryo entwickeln kann, wird die befruchtete Eizelle in eine auf die Trächtigkeit vorbereitete Maus implantiert. Etwa ein Viertel der neugeborenen Mäuse weist das Transgen in seinem Erbgut auf. Die Methode wird auch bei zahlreichen anderen Tierarten wie beispielsweise Ratte, Kaninchen, Schwein, Schaf und Rind angewendet.

Für die Mikroinjektion in die Blastozyste werden embryonale Stammzellen verwendet, die dazu in einem Kulturgefäss gezüchtet werden. Sie sind in ihrer Entwicklung noch nicht auf ein bestimmtes Gewebe festgelegt und können sich daher zu allen in der Maus vorkommenden Zelltypen ausdifferenzieren. In diesen Stammzellen wird ein bestimmtes Gen gezielt verändert.

Ausgewählte Zellen, deren Erbgut diese gewünschte Veränderung enthält, werden in die mehrzellige Blastozyste injiziert und diese anschliessend in ein Empfängertier implantiert. Daraus entstehen Nachkommen, deren Gewebe sowohl aus gentechnisch veränderten als auch aus normalen Zellen zusammengesetzt sind. Durch Weiterzucht solcher Chimären werden in den nachfolgenden Generationen Tiere erhalten, die die gewünschte genetische Veränderung in der Gesamtheit ihrer Zellen tragen. Im Unterschied zur Mikroinjektion in den Kern einer befruchteten Eizelle können mit dieser Methode vorhandene Gene gezielt ausgeschaltet oder verändert werden. Dieses Verfahren der gezielten Mutagenese konnte bei Säugetieren bisher nur bei der Maus erfolgreich angewendet werden.

Knockout-Mäuse

Knockout-Mäuse, bei denen gezielt ein Gen inaktiviert wurde, dienen als Modelle zur Erforschungvon Krankheiten des Menschen

Quelle: Dr. Horst Blüthmann, PRBG-T, Roche

Mikroinjektion von Transgenen	Gezielte Mutagenese: Blastozysten-Injektion

Quelle: Dr. Horst Blüthmann, PRBG-T, Roche

Nachweis der Amyloidose

Lichtmikroskopische Aufnahmen von Ablagerungen aus Amyloid beta (A beta) Peptid in histologischen Schnitten durch das Gehirn einer doppeltransgenen Maus. Auffallend ist die spezifische Bindung von [125l]A beta an A beta-Ablagerungen im Hippocampus (Bild oben links), sowie die immunpositiven Färbung mit einem Antikörper gegen A beta in der Grosshirnrinde (oben rechts), beide nach Nissl-Färbung. Das linke untere Bild zeigt die A beta-Ablagerungen nach Kongorot-Färbung. Unten rechts wird die doppelbrechende Eigenschaft der A beta-Ablagerung mittels Polarisationsmikroskopie deutlich.

Quelle: Dr. Grayson Richards, PRBN-P, Roche

Verteilung der GABAA-Rezeptoren im Mäusehirn

GABAA-Rezeptoren mit verschiedenen alpha-Untereinheiten sind in den verschiedenen Bereichen des Gehirns nicht gleichmässig verteilt. Der die sedative Wirkung von Valium vermittelnde Subtyp alpha1 kommt vor allem in der Rinde des Gross- und Kleinhirns sowie im Thalamus und Pallidum vor, während alpha2 sich vorrangig im Striatum, Hippocampus, Amygdala und Hypothalamus findet. Der alpha3-Subtyp ist typisch für die monoaminergen und serotonergen Neuronen des Hirnstamms und die cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns. Der alpha5-Subtyp wird hauptsächlich im Hippocampus nachgewiesen.

Quelle: Prof. Jean-Marc Fritschy, Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Zürich