Molekulare Computergrafik unterstützt Wirkstoffsuche und Strukturaufklärung

Biologische Zellmoleküle vom Bildschirm aus „in Form gebracht"

In der pharmazeutisch-chemischen Forschung gewinnt die Aufklärung der dreidimensionalen Strukturen von Wirkstoffen und ihren Zielproteinen zunehmend an Bedeutung. Mit Hilfe des computergestützten „Molecular Modellings" kann die Gestalt kleiner Moleküle am Bildschirm derart angepasst werden, dass sie in der Lage sind, selektiv an Rezeptoren zu binden oder Enzyme direkt an deren aktivem Zentrum zu blockieren. Das Molekülmodelling ist bei Roche in verschiedenen Forschungsprojekten zur Ermittlung der optimierten Zielsubstanz beteiligt. Als Beispiele im Zusammenhang mit der Entwicklung von Proteasehemmern seien zwei Wirkstoffe genannt: Der eine blockiert das im Menschen zum Bluthochdruck beitragende Renin. Saquinavir hemmt die zur Vermehrung des Humanen Immunschwäche Virus notwendige Proteinase.

1. Molekülgraphik zur Optimierung der Leitstruktur

Um in einem Screening in kurzer Zeit Hunderttausende von potenziellen Wirkstoffen durchmustern zu können, wird vor allem auf einfache, molekulare Testsysteme zurückgegriffen. Dabei ermöglicht die Automatisierung mit Hilfe von Robotersystemen einen sehr hohen Probendurchsatz (Ultra High Throughput Screening). Die von den Chemikern zu Projektbeginn ausgewählte Leitstruktur weist im allgemeinen bereits eine zumindest geringe, erwünschte biologische Wirkung auf. Um das Potential und die Selektivität der Substanz weiter zu steigern, werden durch gezielte Variationen unter Einbeziehung möglicher physikalisch-chemischer Eigenschaften verschiedene Analoge von dieser hergestellt und untersucht.
Die Kenntnis von 3D-Strukturen verschiedener Molekülen wie von Enzymen, Rezeptoren oder auch Nukleinsäure-Komplexen spielt bei der Suche nach Wirkstoffen eine zunehmende Rolle. In diesem Zusammenhang tragen auch Molekül-Graphiksysteme zur Entdeckung von Leitstrukturen und deren Optimierung bei. Unter dem Begriff Molekülmodelling wird die Berechnung, Darstellung und Bearbeitung von realistischen dreidimensionalen Molekülstrukturen und ihren physikochemischen Eigenschaften verstanden.

2. Röntgenstrahlen helfen bei der Ermittlung der molekularen Raumstruktur

Zur Aufklärung der 3 D-Struktur von Molekülen, einschliesslich der von Proteinen, tragen aber auch noch andere Techniken wie beispielsweise die Röntgen-Kristallstrukturanalyse bei. Für deren Anwendung liegen die Moleküle einer Probe als hochreine, regelmässig geformte Kristalle mit einer Kantenlänge von meist weniger als einem Millimeter vor. Vereinfacht beschrieben werden auf diese Kristalle Röntgenstrahlen geschossen, die an den Elektronenhüllen der Atome einer Ablenkung unterliegen. Aus den gemessenen Strahlenintensitäten lassen sich die Positionen der Atome berechnen. Mit diesem Verfahren ist es sogar möglich, die dreidimensionalen Strukturen von grösseren Molekülen zu bestimmen, die sich aus bis zu etwa 1000 Aminosäuren zusammensetzen.
Zum Studium kleiner Proteine oder Proteinstrukturen wird heute zunehmend die hochauflösende Kernmagnetresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR)-Spektroskopie eingesetzt. Dafür werden die in Lösung befindlichen Moleküle von Wellen im Radiofrequenzbereich bestrahlt und die resultierende Absorption gemessen. Hieraus lässt sich die 3 D-Struktur des Proteins berechnen.

3. Einige Details zum Molecular Modelling

Aus der grossen Zahl rechnerisch denkbarer Varianten können am Bildschirm durch Anpassung der Molekülgeometrie und Einbeziehung der Wechselwirkungen die optimalen Strukturen ausgewählt und damit gegebenenfalls eine Konzentration von Labortests auf die erfolgversprechendsten Strukturen erreicht werden. In anderen Arbeitsgruppen erfolgen dann die Synthese solcher Wirkstoffkandidaten und die Durchführung weiterer Tests, wie beispielsweise auf Bioverfügbarkeit und Toxizität.
Zur Erzeugung eines Startmodelles gibt es Standardprogramme, die Moleküle nach dem Prinzip eines molekularen Baukastens zusammensetzen und dabei abgespeicherte Listen von Bindungslängen und -winkeln sowie bevorzugten Geometrien molekularer Fragmente einbeziehen.
Die Software führt alle molekularen Berechnungen mit Hilfe von Kraftfeldern aus. Ziel einer Kraftfeldrechnung ist die Ermittlung einer energetisch günstigen dreidimensionalen Struktur eines Moleküls oder eines aus mehreren Molekülen bestehenden Komplexes. Die zwischen den Atomen wirkenden Kräfte werden in Form einer analytischen Funktion mit anpassbaren Parametern beschrieben.
Beim Entwurf neuer Moleküle am Computer wird die chemische Synthetisierbarkeit vermehrt berücksichtigt. Aus den Bindungsenergien zwischen Rezeptor und Zielstruktur kann auf eine bestmögliche Struktur gefolgert werden. Eine Deformierung oder Streckung von Bindungen benötigt bestimmte Energiebeträge. Steht ein konstruiertes Molekül unter zu grosser Spannung, so würde es sich in der Praxis nicht bewähren.
Zusammen mit der entsprechenden Software ermöglichen Spezialausrüstungen wie 3 D-Brille und stereofähiger Monitor die Darstellung und Betrachtung der Molekülstrukturen. Das farbige Bild kann gedreht, näher herangeholt als auch Einzelteile herausvergrössert werden. Auf diese Weise lässt sich das Molekül von jeder Seite, innen, aussen und aus allen Entfernungen anschauen. Zur korrekten räumlichen Darstellung werden bei Bedarf auch Daten einer öffentlich zugänglichen Datenbank einbezogen. Diese enthält nach dem Stand vom August 1999 über 10.000 Strukturen von Makromolekülen und etwa 200.000 von kleinen Molekülen. Bei Roche sind bislang mehr als 300 Strukturen von Proteinen und Proteinliganden bestimmt worden.

4. In den Hohlraum des Enzyms eingepasst

Biologisch aktive und für bestimmte Funktionen spezifische Proteine wie Enzyme sind meist sehr komplex zusammengesetzt. Sie bestehen durchschnittlich aus 100 bis 400 Aminosäuren und 1000-4000 Nichtwasserstoff-Atomen. Die Aminosäuren liegen als Grundbausteine in einer durch die Erbinformation in den Genen festgelegten Abfolge vor. Aus dieser Sequenz lässt sich auch der Ähnlichkeitsgrad zu anderen, bekannten Proteinen feststellen und auf die für die biologischen und physikochemischen Eigenschaften des Moleküls massgebliche dreidimensionale Faltung schliessen. Liegen weitgehende Übereinstimmungen (Homologien) vor, so wird häufig zunächst mit Hilfe des Molecular Modellings ein Molekül-Modell erzeugt und dabei auf bekannte Strukturen verwandter Moleküle zurückgegriffen. Durch die verbesserte Einpassung eines optimierten Wirkstoffmoleküls X ("Schlüssel") in das Enzym A ("Schloss") unter Berücksichtigung der Bindungsstabilität steigt häufig auch dessen Aktivität. Je selektiver und passgenauer solch ein X konstruiert ist, desto eher wird es sich nur mit dem Zielmolekül verbinden, auf das es stimulierend oder hemmend wirken soll. Ist die Rezeptorstruktur bekannt, können Varianten von X mit Hilfe einer Computer-gestützten Bewegung automatisch in das aktive Zentrum des Enzyms A hinein manövriert werden. Strukturen, welche nicht in diesen Hohlraum passen oder ihn nur unbefriedigend ausfüllen, werden ausgesondert. Wird das aktive Zentrum von A mit der optimierten Struktur X wirkungsvoll blockiert, kann es seiner eigentlichen Aufgabe, der Umsetzung natürlicher Substrate, nicht mehr nachkommen.

5. Das aktive Zentrum von Proteasen wird blockiert

Die mit dem Molekülmodelling erzielbaren Erkenntnisse wurden beispielsweise in Projekten ausgenutzt, bei denen die Suche nach effektiven Proteasehemmern im Mittelpunkt stand. Proteasen spalten Polypeptidketten, beispielsweise zum enzymatischen Abbau oder zur Freisetzung eines aktiven Proteins oder Peptids aus einer inaktiven Vorgängerform.
Die Aspartylprotease Renin wird in der Niere gebildet und leitet innerhalb einer blutdruckregelnden Stoffwechsel-Kaskade den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt ein. Das Enzym spaltet das im Blut zirkulierende und von der Leber gebildete, aus 10 Aminosäuregruppen bestehende Angiotensinogen unter Freisetzung des Angiotensin I ab. Von jenem entfernt das sogenannte Angiotensin-Converting („umwandelnde")-Enzym zwei Aminosäuren, was zur Formation von Angiotensin II führt. Da diese Substanz die Salz- und Wasserausscheidung im Körper hemmt, erhöht sich der Blutdruck. Eine gezielte Blockierung des Renins gleich zu Beginn des Stoffwechselweges hat daher therapeutische Bedeutung für die Senkung des Bluthochdrucks.
Zu diesem Zweck wurden bereits viele Wirkstoffe synthetisiert, wovon jedoch noch keines als Medikament auf den Markt gekommen ist. Es ergaben sich nämlich Probleme aufgrund der enthaltenen Molekülbestandteile, die zu schnell vom Körpers ausgeschieden wurden. Teilweise waren auch die Herstellungskosten zu hoch. Inzwischen konnte bei Roche eine neue Klasse von Inhibitoren mit einer Piperidinkomponente entwickelt werden, die keine Aminosäuren oder andere vergleichbare Peptidbausteine enthalten und auch besser bioverfügbar sind.
Aids ist eine Infektionskrankheit, die durch das Immunschwäche-Virus (HIV) verursacht wird. Die zum Aufbau neuer Virus-Einheiten benötigten funktionellen Proteine hängen zunächst in langen Polypeptidketten zusammen. Diese müssen an der richtigen Stelle gespalten werden, bevor neue Viren reifen und die Infektion weiterverbreiten können. Dies wird von der viralen Protease übernommen. Der Wirkstoff Saquinavir von Roche ahmt die Proteine nach, die üblicherweise von der HIV-Protease gebunden werden. Dadurch wird das aktive Zentrum des Enzyms blockiert. Es können keine Proteinketten mehr zerschnitten werden, und die Entwicklung der viralen Partikel bleibt unvollständig. Die ersten 3 D-Strukturen sowohl des Enzyms als auch einiger Enzym-Inhibitor-Komplexe wurden 1989 bestimmt. Das mit Hilfe des rationalen Computerdesigns in Roche Welwyn, UK, entwickelte Molekül besitzt sechs asymmetrische Kohlenstoffatome mit jeweils vier Bindungen. Jede Änderung der Stereochemie an einem der sechs Zentren führt zu einem Wirkungsverlust. Saquinavir füllt die Bindungstasche des Enzyms vollständig aus und passt in die Protease hinein wie ein Schlüssel in sein Schloss. Das Medikament stellt den Prototyp der Substanzklasse der Protease-Hemmer dar, welcher Modellcharakter für nachfolgende Vertreter dieser Substanzklasse hatte.

Nichtpeptidischer Renin-Inhibitor

Einpassung des Invirase-Inhibitors